大肠菌群测定的操作细则 　　大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌.该菌主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能. 　　食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示. 　　1设备和材料 　　1.1温箱：36±1℃. 　　1.2冰箱:4℃. 　　1.3恒温水浴:44.5±0.5℃. 　　1.4天平. 　　1.5显微镜. 　　1.6均质器或乳钵. 　　1.7平皿:直径为90mm. 　　1.8试管. 　　1.9吸管. 　　1.10广口瓶或三角烧瓶:容量为500mL. 　　1.11玻璃珠:直径约5mm. 　　1.12载玻片. 　　1.13酒精灯. 　　1.14试管架. 　　2培养基和试剂 　　2.1乳糖胆盐发酵管:按GB4789.28中4.9规定. 　　2.2伊红美蓝琼脂平板:按GB4789.28中4.25规定. 　　2.3乳糖发酵管:按GB4789.28中4.10规定. 　　2.4EC肉汤:按GB4789.28中4.11规定. 　　2.5磷酸盐缓冲稀释液:按GB4789.28中3.22规定. 　　2.6生理盐水. 　　2.7革兰氏染色液:按GB4789.28中2.2规定. 　　3操作步骤 　　3.1检样稀释 　　3.1.1以无菌操作将检样25mL(或g)放于有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液.固体检样最好用均质器,以8000-10000r/min的速度处理1min,做成1:10的均匀稀释液. 　　3.1.2用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液. 　　3.1.3另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL灭菌吸管. 　　3.1.4根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度,接种3管. 　　3.2乳糖发酵试验 　　将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内,接种量在1mL以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,1mL及1mL以下者,用单料乳糖胆盐发酵管.每一稀释度接种3管,置36±1℃温箱内,培养24±2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则按下列程序进行. 　　3.3分离培养 　　将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上,置36±1℃温箱内,培养18-24h,然后取出,观察菌落形态,并做革兰氏染色和证实试验. 　　3.4证实试验 　　在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1-2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置36±1℃温箱内培养24±2h,观察产气情况.凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌,即可报告为大肠菌群阳性. 　　3.5报告 　　根据证实为大肠菌群阳性的管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)大肠菌群的MPN值. 　　4粪大肠菌群(faecalcoliform) 　　4.1用接种环将所有产气的乳糖胆盐发酵管培养物(见3.2条)转种于EC肉汤管内,置44.5±0.2℃水浴箱内(水浴箱内的水面应高于EC肉汤液面),培养24±2h,经培养后,如所有EC肉汤管均不产气,则可报告为阴性;如有产气者,则将所有产气的EC肉汤管分别转种于伊红美蓝琼脂平板上,置培养18-24h,凡平板上有典型菌落者,则证实为粪大肠菌群阳性. 　　4.2结果报告 　　根据证实为粪大肠菌群的阳性管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)粪大肠菌群的MPN值. 　　若有较多典型大肠菌群菌落,革兰氏染色为阴性,即可直接判定为阳性. 　　若少或均不够典型,应多挑选菌落作证实实验,以免出现假阴性. 　　SN/T1897-2007食品中菌落总数的测定也可以用于与食品接触的设备表面的.附录A. 　　另有自定的 　　例一： 　　物体表面采样及检查方法 　　采样面积 　　被采表面＜100cm2,取全部表面；被采表面≥100cm2,取100cm2. 　　采样方法 　　用5×5cm2的标准灭菌规格板；放在被检物体表面,用浸有无菌生理盐水液的棉拭子1支,在规格板内横竖往返各涂抹5次；并随之转动棉拭于.连续采样1～4个规格板面积；剪去手接触部分,将棉拭于放入装10ml采样液的试管中送检.门把手等小型物体则采用棉拭子直接涂抹物体的方法采样. 　　培养（略）