问题标题:
【确定血清白蛋白纯度和生物活性鉴定方法并且确定所用试剂仪器,】
问题描述:
确定血清白蛋白纯度和生物活性鉴定方法并且确定所用试剂仪器,
柴苍修回答:
标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量
一、标准曲线一般用分光光度法测物质的含量,先要制作标准曲线,然后根据标准曲线查出所测物质的含量.因此,制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术.
二、蛋白质含量测定方法1、凯氏定氮法2、双缩脲法3、Folin-酚试剂法4、紫外吸收法5、考马斯亮蓝法三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作(一)、试剂:1、考马斯亮蓝试剂:考马斯亮蓝G—250100mg溶于50ml95%乙醇,加入100ml85%H3PO4,雍蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤.最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝G—250,4.7%(W/V)乙醇,8.5%(W/V)H3PO4.2、标准蛋白质溶液:纯的牛血清血蛋白,预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液.(二)、器材:1、722S型分光光度计使用及原理().2、移液管使用().(三)、标准曲线制作:试管编号0123456100ug/ml标准蛋白(ml)0.00.10.20.30.40.50.60.15mol/LNaCl(ml)10.90.80.70.60.50.4考马斯亮蓝试剂(ml)5555555摇匀,1h内以1号管为空白对照,在595nm处比色A595nm
2、以A595nm为纵坐标,标准蛋白含量为横坐标(六个点为10ug、20ug、30ug、40ug、50ug、60ug),在坐标轴上绘制标准曲线.1)、利用标准曲线查出回归方程.2)、用公式计算回归方程.3)、或用origin作图,测出回归线性方程.即A595nm=a×X()+6一般相关系数应过0.999以上,至少2个9以上.4)、绘图时近两使点在一条直线上,在直线上的点应该在直线两侧.(四)、蛋白质含量的测定:样品即所测蛋白质含量样品(含量应处理在所测范围内),依照操作步骤1操作,测出样品的A595nm,然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量.一般被测样品的A595nm值在0.1—0.05之间,所以上述样品如果A595nm值太大,可以稀释后再测A595nm值,然后再计算.(五)、注意事项:1、玻璃仪器要洗涤干净.2、取量要准确.3、玻璃仪器要干燥,避免温度变化.4、对照:用被测物质以外的物质作空白对照.
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