问题标题:
如何构建RNA干扰载体?另外简短的解释下正义表达载体和反义表达载体的意思
问题描述:

如何构建RNA干扰载体?

另外简短的解释下正义表达载体和反义表达载体的意思

沈建伟回答:
  在RNA干扰实验中   首先需要构建dsRNA表达载体   将这种载体导入受体细胞中后   表达产生的dsRNA在DICER酶作用下形成siRNA   引起具有相同序列的mRNA发生讲解   导致细胞或个体不能合成相应的蛋白质   所以个体会表现出功能缺失表型   构建表达载体通常选用dsRNA   需要注意的一些方面是   dsRNA序列中GC的含量要小于50%   高GC含量会降低RNAi的效果   选定的dsRNA序列应通过搜索数据库确保与其他基因无同源性   以避免对其他同源性基因表达的抑制   不同区域的dsRNA具有不同的基因沉默效果   可同时构建两个以上针对同一基因不同靶区域的dsRNA表达载体   还要充分考虑siRNA的结构特征   siRNA与mRNA的同源程度对RNAi有明显影响   启动子区或者编码区与siRNA同源的基因受siRNA抑制   但siRNA在动物细胞中对mRNA的前体没有影响   所以含非编码区序列的dsRNA不会引起RNAi   而且在构建表达载体时   经常使用U6启动子等RNA聚合酶Ⅲ能够识别的启动子序列   最后将其转入到质粒中   这里说的只是一个简单的过程   总的来说构建表达载体是个比较复杂的过程   如果要知道详细的技术   建议还是去看书吧   这里是说不清的   推荐一本书   上面什么都有   正反义表达载体就是把目的基因正向或者反向插入到质粒中再转染   质粒中含有正向插入目的基因的就是正义表达载体   含有反向插入的就是反义表达载体
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