【我要检测的蛋白是100KD,配置了8%的分离胶,该用多大的电压来跑分离胶?我用了120V，但是不到一个小时就跑完了，时间短对目的蛋白的分离有没有影响？】|初中生物问答-字典翻译问答网

问题标题：

【我要检测的蛋白是100KD,配置了8%的分离胶,该用多大的电压来跑分离胶?我用了120V，但是不到一个小时就跑完了，时间短对目的蛋白的分离有没有影响？】

问题描述：

我要检测的蛋白是100KD,配置了8%的分离胶,该用多大的电压来跑分离胶?

我用了120V，但是不到一个小时就跑完了，时间短对目的蛋白的分离有没有影响？

罗丽萍回答：

　　WesternBlottingProtocol 　　1.细胞裂解　　只用于western的细胞可以直接用1%SDS/PBS裂解,要用于IP,co-ip之类的实验的蛋白用裂解液I&II的方法（这个我还没有涉及到）. 　　1）收细胞：贴壁细胞直接洗掉培养基,再用PBS清洗两遍后直接置于液氮中,-80°C保存.悬浮细胞低速离心2min,用PBS清洗后,直接置于液氮中,-80°C保存. 　　2）加入适量的1%SDS,混匀,100°C,5-10min.13400rpm,4°C,20min. 　　3）取上清于新管中. 　　4）测量浓度：采用分光光度法　　BCAproteinAssayReagentA：500μl 　　Sample:5μl 　　BCAproteinAssayReagentA：10μl 　　PS:根据蛋白的浓度曲线得到相应的浓度. 　　2.跑胶　　配胶的protocol和咱们实验室差别不大,各人可能根据习惯对一些数据稍作调整都关系不大. 　　上样量：3μg-15μg,根据蛋白峰值的不同进行调整. 　　200V电压跑45min左右　　3．转膜（半干转）　　1）将胶小心从板上拿下来,置于transferbuffer中（1×transferbuffer中加入20%甲醇）洗掉runningbuffer,15min. 　　2）将NC膜置于100%甲醇中激活一分钟. 　　3）将胶转到NC膜上,注意防止气泡（可用温度计之类的赶掉气泡）,17V恒压20min. 　　4）将膜转入乘有TBST的容器中（注意始终保持膜的湿润）. 　　5）5%的牛奶在室温blocking1h. 　　4．杂一抗　　用TBST洗掉牛奶（如果一抗是溶于牛奶中则不用洗的很干净）. 　　PS:根据抗体特性的不同,有些抗体要溶于冷牛奶（4°C）中,有些抗体要溶于TBST中. 　　加入一抗,一张膜1ml就够,封于塑料封口膜中,注意赶走气泡,4°C过夜. 　　5．杂二抗　　用TBST洗净一抗（一抗可重复使用）,加入二抗室温1h. 　　6．显色　　这里用的是老式的拍照手法. 　　洗净二抗,准备显色液：显色液以TBST:显色液I:显色液II(咱们实验室有的那种,名字我没记下来)=2:1:1的比例配好（可根据蛋白信号的强弱调整）. 　　将膜侵入显色液中incubate5min. 　　在暗房里拍照. 　　来自匹兹堡大学吴传越实验室