是现在应用最多的核酸测序技术,由Sanger等1977年提出. 　　其原理是：核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在条件下复制或转录时,如果在四管反应系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基,只要双脱氧碱基掺入链端,该链就停止延长,链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长.如此每管反应体系中便合成以共同引物为5’端,以双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段.反应终止后,分四个泳道进行电泳.以分离长短不一的核酸片段(长度相邻者仅差一个碱基),根据片段3’端的双脱氧碱基,便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序. 　　(一)Sanger双脱氧链终止法(酶法)测序程序操作程序是按DNA复制和RNA反转录的原理设计的. 　　1.分离待测核酸模板,模板可以是DNA,也可以是RNA,可以是双链,也可以是单链. 　　2.在4只试管中加入适当的引物、模板、4种dNTP(包括放射性标记dATP,例如?32PdATP和DNA聚合酶（如以RNA为模板,则用反转录酶）,再在上述4只管中分别加入一种一定浓度的ddNTP(双脱氧核苷酸). 　　3.与单链模板（如以双链作模板,要作变性处理)结合的引物,在DNA聚合酶作用下从5’端向3’端进行延伸反应,32P随着引物延长掺入到新合成链中.当ddNTP掺入时,由于它在3’位置没有羟基,故不与下一个dNTP结合,从而使链延伸终止.ddNTP在不同位置掺入,因而产生一系列不同长度的新的DNA链. 　　4.用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳同时分离4只反应管中的反应产物,由于每一反应管中只加一种ddNTP(如ddATP),则该管中各种长度的DNA都终止于该种碱基(如A)处.所以凝胶电泳中该泳道不同带的DNA3’末端都为同一种双脱氧碱基. 　　5.放射自显影.根据四泳道的编号和每个泳道中DNA带的位置直接从自显影图谱上读出与模板链互补的新链序列. 　　(二)双脱氧测序的示剂及具体操作步骤（以双链DNA测序为例）. 　　1.变性双链模板的制备 　　(1)材料Tris/葡萄糖缓冲液(20mmol/LTris-HClpH8.0,10mmo1/LEDTA,50mmo1/L葡萄糖),1％SDS,0.2mo1/LNaOH,异丙醇,TE缓冲液pH8.0,4mol/LLiCl,冰冷70％和无水乙醇,2mol/LNaOH,2mmol/LEDTA. 　　(2)配制方法 　　①取1.5ml处于对数生产期的培养菌液(含有待测病毒核酸的重组质粒模板),离心除去上清液后,用150?lTris/葡萄糖缓冲液重悬菌团,在室温下放置5分钟. 　　②加入300?l的1％SDS,0.2mol/LNaOH,颠倒混合约15次,在室温下放置15分钟,加入225ml3mol/L醋酸钠(pH4.5),颠倒约15次混合,在冰浴中放置45分钟,然后离心5分钟. 　　③将650?l上清液转移至一支新管中,加入650?l异丙醇,混合后在室温下放置10分钟,离心5分钟后弃去异丙醇,抽真空干燥沉淀. 　　④用125?lTE(pH8.0)重新溶解DNA,加入375?l的4mol/LLiCl,在冰浴中放置20分钟后,于4℃下离心5分钟. 　　⑤将上清液转移至一支新管中用饱和苯酚抽提后再用氯仿抽提,加入2倍体积的异丙醇,在室温下沉淀30分钟,离心5分钟,弃去上清液. 　　⑥用冰冷的70％乙醇洗沉淀,离心5分钟,弃去上清液并干燥,用50?lTE缓冲液重新溶解沉淀.用紫外分光光度计测定质粒DNA含量. 　　⑦取0.2?g质粒DNA,并将体积调至9?l,加入1?l2mol/LNaOH,2mmol/LEDTA,在室温下放置5分钟,加入2?l30mol/L醋酸钠(pH4.5)和8?l水. 　　⑧加入6?l冰冷无水乙醇,混合后在干冰／乙醇浴中放置15分钟,在4℃下离心5分钟,小心地弃去上清液,用冰冷的70％乙醇洗沉淀,离心5分钟并小心地弃去上清液,真空抽干沉淀,并用TE缓冲液重新溶解沉淀. 　　2.延伸和终止反应以利用T7DNA聚合酶进行的双脱氧链终止反应为例. 　　(1)材料变性的双链DNA模板(溶解在TE缓冲液中),0.5pmol/?L寡核苷酸引物(溶解在TE中,-20℃贮存),5×测序缓冲液(200mmol/LTrispH7.5,50mmol/LMgCl2,-20℃贮存),0.1mol/lDTT(当月新配-20℃贮存),15pmol/L的3种dNTP混合物(缺dATP),1000至1500Ci/mmol?32pdATP(在－20℃下达4至6周),修饰的T7DNA聚合酶,标准酶稀释溶液(20mmol/LTris－HClpH7.5,0.5mg/mlBSA,10mmol/L?-巯基乙醇,4℃贮存),终止混合物(表2-30),甲酰胺上样缓冲液(0.2ml0.5mol/LEDTApH8.0,10mg溴酚蓝,10mg二甲苯青,10ml甲酰胺). 　　表2-30T7DNA聚合酶终止反应混合物 　　反应成分ddGddAddTddC最终浓度 　　H2O15151515－ 　　5×测序缓冲液6666－1mmol/L 　　4dNTP6666200μmol/L 　　1mmol/LddGTP3－－－20μmol/L 　　1mmol/LddATP－3－－20μmol/L 　　1mmol/LddTTP－－3－20μmol/L 　　1mmol/LddCTP－－－320μmol/L 　　(2)配制方法 　　①取4支0.5?l小离心管,标上G、A、T、C,每管加入7?l变性的双链DNA模板(分别为1和2?g),1?l寡核苷酸引物和2?l5×测序缓冲液混合,65℃保温2分钟,在室温下冷却30分钟. 　　②每管加入1?l0.1mol/LDTT,2?l1.5mol/L3种dNTP混合物,0.5?l?32PdATP和2?l(2IU)修饰的T7DNA多聚酶混合物,在室温下放置5分钟. 　　③按标记每管分别加入3?l4种ddNTP终止混合物的一种. 　　④短促离心后,在37℃下保温5分钟. 　　⑤加入5ml甲酰胺上样缓冲液,上样前在80℃下加热2分钟,并迅速置于冰浴上,每个样品取3?l,上样电泳. 　　3.测序反应物电泳和序列读取 　　(1)按普通聚丙烯酰胺凝胶制作方法制作梯度胶. 　　(2)按G、A、T、C次序加入每种样品,在G、A和T各泳道上样1ml,而在C泳道上样1.5?l. 　　(3)上样完毕加压1700V电泳,根据样品中溴酚蓝和二甲苯青染料迁移情况确定电泳时间. 　　(4)电泳完毕,在10℃冰醋酸中漂洗30分钟脱去尿素.