（2012•宝山区二模）发光细菌检测法在检测生物毒性的方法中具有灵敏、简便的特点而被广泛采用．
实验原理：细菌代谢正常时，发光细菌的发光强度稳定，并可维持较长时间；当外界环境影响到发光细菌代谢时，发光会立即受到抑制，且抑制程度与影响物质浓度大小呈相关关系．
实验材料：明亮发光杆菌（海水细菌）、待测海水水样、2%的NaCl溶液、3%NaCl溶液、生物毒性测试仪（用于测定细菌发光强度）、全温振荡器、试管等．
Ⅰ．发光细菌的培养
发光细菌可以直接从海水中和海鱼的体表和内脏中分离，所采用的培养基成分为：胰蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，甘油0.3%，KH2PO40.1%，Na2HPO40.5%，NaCI3%，琼脂2%，pH6.5．
（1）发光细菌为______（自养型/异养型）．取海鱼内脏放入灭菌培养皿中20℃培养12-18小时，在暗室中寻找发光点，用______刮取少许菌苔，在______培养基中采用______法获得纯化的发光菌株．使用前接种到______培养基中20℃下振荡培养10-12小时，增殖后用磷酸缓冲液稀释后备用．
Ⅱ．海水中重金属污染程度测定
a、配制发光菌悬液；
b、抑光反应：按照下表配置海水样品稀释液；
表1海水中重金属污染程度测定
| 试管编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 3%NaCl溶液（mL） | 4.74 | 4.49 | 4.24 | 3.99 | |
| 海水样品（mL） | 0.25 | 0.50 | 0.75 | 1.00 | |
| 发光菌悬液（mL） | 0.01 | 0.01 | 0.01 | 0.01 | |
| 混合液中海水浓度（%） | 0.05 | 0.10 | 0.15 | 0.20 |
（3）请在表格中填写适当的数据．
（4）利用生物毒性测试仪测定各试管的______（测定指标）．
Ⅲ．五氯酚钠毒性测定
资料：五氯酚钠在水中以五氯苯酚阴离子和五氯苯酚分子平衡存在；五氯苯酚比五氯酚钠的极性小得多，更容易通过生物膜而与细菌细胞相接触．实验温度25℃下，pH为6.0、7.0、8.0、9.0时，pH每升高1个单位，分子态五氯苯酚所占的比例就下降一个数量级．
a、将五氯酚钠配成5个左右浓度等级，将接种后12h的菌液1-2mL用20-30mL3%NaCl溶液稀释混合，磁力搅拌10min 后，取0.2mL加入比色管中，上下振荡5次，去塞，静置15min后用生物毒性测试仪测定发光强度．
b、计算相对发光率
相对发光率（RL）=测试管发光量mV/对照管发光量mV×100%
计算对应相对发光率减小50%的物质浓度（EC50）
c．不同pH条件下，五氯酚钠毒性测定
发光细菌适宜生存的pH值为6.0-9.0
表2 不同pΗ 值下五氯酚钠毒性测定结果/㎎•L-1
| pΗ | 6.0 | 7.0 | 8.0 | 9.0 |
| EC50值 | 1.74 | 2.41 | 9.39 | 15.94 |
（6）据资料分析可能的原因：______．
